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biologie

biologie

techniques de laboratoires pour laboratoire de brousse

COLORATION DE GRAM

Réactif n°1 : Violet de gentiane phéniqué

Violet de gentiane 1g

Acide phénique 2g

Alcool à 95° 10ml

Eau distillée 100ml

Préparation du réactif n°1 :

Broyer au mortier le violet de gentiane et l’acide phénique ; ajouter l’alcool, puis peu à peu l’eau distillée. Laisser en contact 24 heures. Laisser reposer et filtrer.

Réactif n°2 : Solution iodo-iodurée de Lugol faible ( liquide de Gram)

Iode 1g

Iodure de potassium 2g

H2O distillée 200 ml

Préparation du réactif n°2 :

Dissoudre d’abord l’iodure de potassium dans environ 30ml d’eau distillée, ajouter l’iode et mélanger jusqu’à dissolution. Ajouter le reste d’eau distillée, mélanger.

Conserver dans un flacon de verre brun ou en plastique opaque (à l’abri de la lumière).

Réactif n°3 : réactif de décoloration

Quatre formules de réactif de décoloration sont proposées :

a)Acétone (à conserver au frigidaire) 10ml

Alcool absolu 50ml

b)Acétone 34ml

Alcool absolu 66ml

c) Acétone 50ml

Alcool à 95° 50ml

c)Alcool à 95° pur

Réactif n°4 : Fuchsine de Ziehl phéniquée

Fuchsine basique 1g

Acide phénique 5g

Alcool absolu 10ml ou Alcool à 90° 13,2ml

Eau distillée 90ml eau distillée 90ml

Préparation du réactif n°4

Broyer dans un mortier la fuchsine avec l’alcool, ajouter l’acide phénique, puis verser par petites portions en continuant à remuer les 2/3 environ de l’eau distillée. Agiter, laisser reposer 24heures et filtrer.

Le réactif n°4 est la même fuchsine qui sert à la coloration pour la recherche des bacilles de Koch.

Tous les réactifs sont en vente à la Cooper de Melun

Technique de la coloration de Gram

- Fixer la lame à la chaleur ou à l’alcool

- Recouvrir la lame de violet de gentiane phéniqué 1mn

- Chasser le violet de gentiane avec du lugol en penchant la lame

- Recouvrir la lame de lugol faible 1mn

- Différencier à l’alcool acétone, c'est-à-dire faire couler l’alcool acétone (réactif de décoloration) sur la lame en penchant celle-ci jusqu’à ce que le liquide s’écoule incolore

- Rincer immédiatement à l’eau du robinet

- Recouvrir la lame d’eau et ajouter

- Quelques gouttes de fuchsine pure 30 secondes

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